La leggenda vuole che l'isola si sia formata nel 510 a.C. dai fasci di spighe del grano mietuto nelle proprietà del re Tarquinio il Superbo, appena cacciato da Roma. In antichità, ospitava il tempio di Esculapio, dio della medicina, il cui culto fu introdotto in seguito ad una pestilenza. Nella prima metà del I secolo a.C. venne monumentalizzata riprendeva la forma di una nave, di cui oggi è ncora visibile la prua.
Durante il medioevo, sopra le rovine del tempio, venne costruita una basilica per accogliere le relequie di San Bartolomeo Apostolo. All'interno della chiesa, il pozzo che si vede occuperebbe il posto di una fonte che era nell'antico santuario di Esculapio. Ancora oggi alcuni rilievi in travertino sullo scafo della nave attestano il culto del dio.
Sull'Isola in epoca romana sono attestai altri culti: quello di Giove Giurario sotto l'Ospedale Fatebenefratelli, il culto di Veiove, Fauno, la divinità sabina Semo Sancus e Tiberino. Notevoli i due ponti romani che ancora oggi permettono l'accesso all'Isola: io ponte Cestio ed il ponte Fabricio entrambi del I secolo a.C.
La vocazione medica dell'Isola proseguirà nei secoli con la nascita dell'Ospedale Fatebenefratelli fondato dai seguaci di San Giovanni di Dio nel 1585, rimodernato tra il 1930 ed il 1934. Tutta la zona divenne lazzaretto i occasione della peste del 1656.
Nel 1882 venne istituito sull'Isola, l'Opedale Israelitico in un'ala del convento di San Bartolomeo, allora di proprietà comunale. In effetti la vocazione sanitaria dell'Isola non cessò mai, quasi sicuramente per la sede stessa, un'isola, che permetteva appunto l'isolamento dei malati.